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      公司與北京生命科學研究所/清華大學生物醫學交叉研究院張二荃實驗室合作在《Science Translational Medicine》發表題為“Chemical perturbations reveal that RUVBL2 regulates the circadian phase in mammals”的研究論文
      來源: | 作者:李偉 | 發布時間: 2020-05-13 | 2529 次瀏覽 | 分享到:
      2020年5月6日,北京生命科學研究所/清華大學生物醫學交叉研究院張二荃實驗室和瑞璞鑫(蘇州)生物科技有限公司合作在《Science Translational Medicine》發表題為“Chemical perturbations reveal that RUVBL2 regulates the circadian phase in mammals”的研究論文。研究人員通過嚴格的化學篩選,發現天然產物cordycepin能夠快速調節哺乳動物生物鐘相位,并進一步揭示其代謝產物cordycepin 5′-triphosphate通過改變TTFL振蕩器轉錄狀態實現時相調節的機制,有望成為調控生物鐘時相和治療生物鐘紊亂相關疾病的藥物。其中,瑞璞鑫(蘇州)生物科技有限公司的李偉博士,根據SAR分析和藥物研發經驗,推測天然產物cordycepin需要在體內磷酸化后才能與RUVBL2蛋白結合,磷酸化的cordycepin才是體內真正起效的活性產物,并建議研發團隊從研究cordycepin轉為研究磷酸化的cordycepin;基于此建議,張煒博士隨后通過蛋白純化和結晶技術在全球首次獲得并解析了三磷酸cordycepin與RUVBL2蛋白的X-ray共晶結構,并且分析確認了三磷酸cordycepin直接結合在RUVBL2蛋白的ATP結合域,以及能夠被其水解,為cordycepin作用機制提供了強有力的證據。

      原文鏈接:http://www.nibs.ac.cn/newsshow.php?cid=4&sid=15&id=2301

      Science Translational Medicine| 張二荃實驗室發現調節哺乳動物生物鐘相位的潛在藥物并解析其分子機制

      發布時間:2020/05/11

      2020年5月6日,北京生命科學研究所/清華大學生物醫學交叉研究院張二荃實驗室在《Science Translational Medicine》發表題為“Chemical perturbations reveal that RUVBL2 regulates the circadian phase in mammals”的研究論文。研究人員通過嚴格的化學篩選,發現天然產物cordycepin能夠快速調節哺乳動物生物鐘相位,并進一步揭示其代謝產物cordycepin 5′-triphosphate通過改變TTFL振蕩器轉錄狀態實現時相調節的機制,有望成為調控生物鐘時相和治療生物鐘紊亂相關疾病的藥物。

      哺乳動物眾多生命過程都具有明顯的晝夜節律性,如睡眠/覺醒、心率、代謝和激素水平等。這些生理生化水平的晝夜節律都是由機體內源的生物鐘所驅動的。一般認為,晝夜節律生物鐘的作用機制是由轉錄激活因子和轉錄抑制因子組成的轉錄翻譯負反饋環路(transcription-translational feedback loop,TTFL),而且該方向的研究獲得了2017年諾貝爾生理或醫學獎。描述生物鐘節律有三個參數:周期、振幅和相位。生物鐘如何維持24小時周期一直是領域內的研究核心,而關于振幅和相位的調控機制目前了解十分有限?,F代社會中,生物鐘相位與機體健康密切相關,其紊亂會引發多種疾病發生,如倒班和跨時區旅行引發的晝夜節律性睡眠障礙、老年人睡眠時相提前障礙、以及生物鐘時相紊亂導致的代謝疾病等。另一方面,近期研究表明:過去50年里FDA批準的106項臨床實驗中,75%的藥物具有明顯的時間依賴性的藥效和毒性。因此,深入了解生物鐘時相的調控機制可以讓我們更好的利用晝夜節律來輔助疾病治療。


      圖1. 調控生物鐘時相小分子化合物的篩選。(A)化學篩選策略;(B)cordycepin化學結構及其在細胞和組織水平逆轉生物鐘時相;(C)cordycepin可透過血腦屏障進入腦脊液;(D)cordycepin縮短8小時相位提前倒時差模型倒時差所需時間;(E)cordycepin通過腺苷轉運蛋白進入細胞發揮相位調節功能;(F)抑制常見生物鐘時相同步化途徑不影響cordycepin相位調節能力;(G)cordycepin激活生物鐘E-box基因轉錄。


      為了尋找能夠有效調控生物鐘時相的小分子化合物,研究人員首先在細胞中對NIH臨床/臨床前試驗藥物、純化天然產物化合物和合成化合物庫共約10000個化合物,進行了嚴格的化學篩選,最終發現天然產物cordycepin能夠大幅度改變甚至完全逆轉生物鐘時相。更為重要的是,cordycepin是迄今為止唯一能夠透過血腦屏障,作用并調節生物鐘中樞振蕩器SCN相位,從而極大的縮短小鼠倒時差所需時間的小分子化合物。有趣的是,cordycepin在Per2基因表達波谷時能夠增加生物鐘的振幅,其在生物鐘弱化相關疾病中的應用也正在研究中(圖1)。

      Cordycepin化學結構與腺苷極為相似。研究人員進一步通過SAR分析發現,其他117個cordycepin類似物中僅有三個化合物具有逆轉生物鐘時相的能力,從化學結構上看都屬于腺苷類似物。cordycepin通過核苷受體轉運蛋白進入細胞進而發揮生物鐘相位調節功能,阻斷腺苷受體轉運蛋白會完全抑制其相位調節能力。有趣的是,cordycepin的相位調節功能并不是通過目前已知的生物鐘時相同步化途徑實現,抑制這些途徑并不能阻斷其相位調節功能。此外,其他3’-脫氧核苷不能引起生物鐘時相改變,說明cordycepin的相位調節功能不是通過影響RNA合成實現的。給小鼠腹腔注射cordycepin能夠迅速特異性激活生物鐘E-box基因轉錄,這一結果暗示著一個全新的轉錄水平的生物鐘相位調節機制的存在 (圖1)。

      確定cordycepin調節生物鐘時相的作用靶點,研究人員同時采取了兩種途徑進行探索。在齊湘兵實驗室的幫助下,研究人員利用biotin-cordycepin進行IP-MS分析,搜尋其直接作用蛋白。另一方面,研究人員對所有轉錄調節相關的近2000個基因(轉錄因子+表觀修飾因子)進行了chemical-genetic screen,搜尋介導cordycepin誘導相位改變的基因。最終,確認了RUVBL2蛋白為cordycepin誘導相位改變的作用靶點。

      RUVBL2是AAA+ ATPase蛋白家族成員,依賴其ATP水解活性參與細胞內多種過程,如染色質重塑TIP60復合物和生物大分子組裝PAQosome復合物等。有趣的是,RUVBL2的ATP水解活性非常弱,這一生化特質與現已知最簡單的生物鐘模型藍綠藻KaiABC節律振蕩器十分類似。RUVBL2是否會在哺乳動物中發揮類似的作用非常值得關注。Cordycepin進入細胞后會立即轉化為5’-triphosphorylated cordycepin(CoTP),因此抑制其磷酸化則不會產生相位改變,這正說明CoTP是cordycepin的體內活性形式。張煒博士通過共晶結構分析確認了CoTP直接結合在RUVBL2蛋白的ATP結合域,并能夠被其水解。CoTP和RUVBL2之間的結合對相移產生十分重要,通過調節兩者間的親和力(D299Q增強,A85T減弱),CoTP的相移能力也隨之增強或減弱(圖2)。

      圖2. CoTP與RUVBL2相互作用和調控生物鐘時相的結構生物學基礎。(A)抑制cordycepin磷酸化的ADK(adenosine kinase)inhibitor能夠完全阻斷cordycepin相位調節能力;(B,C)CoTP與RUVBL2蛋白結合的共晶結構解析;(D)RUVBL2蛋白水解CoTP動態過程。(E)CoTP和CoDP解離BMAL1/RUVBL2蛋白相互作用;(F)RUVBL2的D299Q和A85T突變體影響其與CoTP的結合親和力;(G)RUVBL2的D299Q和A85T定點突變影響cordycepin相位調節能力。


      經過一系列的生物化學實驗和數學建模分析,研究人員發現RUVBL2能夠與BMAL1直接相互作用,并參與TTFL復合物節律性調節生物鐘基因轉錄的過程。CoTP與RUVBL2結合后會導致BMAL1/RUVBL2解離,進而將TTFL復合物轉錄狀態由抑制狀態轉變為激活狀態,最終促進E-box基因的轉錄,改變生物鐘相位(圖3)。與這一模型相一致的是,當生物鐘TTFL復合物已經處于激活狀態時(即E-box基因表達的波谷),CoTP不能導致相位改變。

      圖3. CoTP與RUVBL2對哺乳動物生物鐘時相調節的機制模型。生物節律相關的E-box基因轉錄受TTFL復合物節律性的組裝和解離調控。這一復合物由轉錄激活因子BMAL1/CLOCK、轉錄抑制因子CRY1/2以及我們新發現的RUVBL2蛋白等組成。當E-box基因表達到峰頂時,TTFL復合物開始裝載抑制性蛋白進而由激活型轉化為抑制型,抑制E-box基因轉錄。此時外源加入CoTP并作用于RUVBL2,會導致TTFL復合物部分解體,抑制性轉錄因子CRY1/2蛋白離開E-box區域,其對E-box基因的抑制得到緩解,而BMAL1蛋白留在E-box區域,促進E-box基因的轉錄。這種促進作用打破了正常的轉錄翻譯反饋,一段時間后,CoTP被細胞降解,TTFL復合物重新組裝,一個新的時鐘振蕩開始出現,最終表現為生物鐘節律相位的改變(卡通示意圖由張二荃實驗室博士生徐占聰和虞子青提供)。


      該研究以化學篩選為切入點,發現cordycepin具有透過血腦屏障、快速調節相位的能力,可作為治療生物鐘時相紊亂相關疾病的潛在候選藥物。另外,該研究還發現RUVBL2蛋白是一個新的生物鐘調控因子,進一步完善了生物鐘的轉錄翻譯負反饋環路,對于生物鐘研究具有重要的指導意義。

      我所張二荃實驗室的鞠大鵬博士和RPXDs (蘇州) 公司的張煒博士為本文共同第一作者。該論文其他作者還包括張二荃實驗室工作人員趙海焦、應淑華,現/前博士生廖媚妹、徐占聰、梅龍博士;RPXDs 公司的李偉博士;北京大學定量中心湯超教授及前學生閆嘉偉、來魯華教授及前學生謝曉雯博士;我所化學中心工作人員王志強、周觀燊;我所王家文博士、蔡濤博士、陳涉博士、黃牛博士及其實驗室工作人員侯楠楠;以及德克薩斯西南醫學中心的Joseph S. Takahashi教授及其博士后Noheon Park。張二荃博士和化學中心主任齊湘兵博士為本文共同通訊作者。這項研究得到了北京市科委、科技部973計劃、國家自然科學基金以及清華大學的資助,在北京生命科學研究所完成。

      附注:這是我所在《Science Translational Medicine》發表的第二篇研究論文。上一篇是2019年黃牛實驗室與張二荃實驗室(及中科院北京基因組所楊運桂課題組)合作的關于開發FTO抑制劑作為減肥藥物和其在糖脂代謝中作用的機制研究。

      論文鏈接:

      https://stm.sciencemag.org/content/12/542/eaba0769

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